В возрасте 30 лет преподобный Иов принял священный сан. Услышав о добродетелях Угорецкого иеромонаха, воевода Киевский князь Константин Константинович Острожский, известный своим покровительством православному просвещению на Волыни, пригласил преп. Иова в свой патрональный Дубенский монастырь (г. Дубно), где преподобный был вскоре поставлен игуменом. С Дубенским монастырем преподобного Иова связали без малого 20 лет настоятельства.
В 1604 г., тяготясь игуменством в благоустроенном патрональном монастыре, преподобный оставил его. Стремясь к отшельническим подвигам, он переселяется на гору Почаевскую, где издавна селились многочисленные безмолвия рачители.
Значение преп. Иова для обители Почаевской было в чем-то схожим со значением преп. Феодосия (†1074) для обители Печерской. Дело в том, что иноки Почаевские подвизались до того времени в значительной мере именно согласно традиции пустынножительства — идоритмии. Этот тип монашества был распространен в первые века христианства на заре появления монашества и впоследствии бытовал на Афоне наравне с общежительным уставом — киновии. Именно с Афона пустынножительство было принесено в древний Киев преподобным Антонием Печерским (†1073). Но у Волынской земли были свои устойчивые связи с Афоном, откуда на протяжении многих столетий черпались духовные идеалы монашеского подвига. Почаевское предание (правда, весьма поздняя — XVIII в.) говорит именно об афонских корнях монашеской жизни на горе Почаевской, возводя её к началу ХІІІ столетия. Согласно этому преданию, основоположником Почаевского монастыря был некий афонский чернец Мефодий, к которому впоследствии стали стекаться монахи из разрушенного Батыевым нашествием Киево-Печерского монастыря. Так или иначе, жизнеустроение Почаевской обители до преподобного Иова действительно было в большей степени пустынническим. История не сохранила даже имен Почаевских настоятелей, так как афонская идиоритмия не обязательно предполагала привычного для нас типа монастыря с настоятелем во главе. Преподобный Иов был в сущности первым настоятелем Почаевского монастыря, преобразовав его в киновию по примеру прочих западнорусских монастырей, основанных на монашеских принципах св. Василия Великого (†379) и Студийского общежительного устава.
По смерти князя Константина Острожского (†1608) и главной благотворительницы Почаевского монастыря княгини Анны Гойской (†1617) у монастыря появилось немало завистников. Так, уже внук княгини Анны — протестант Андрей Фирлей, воевода Бельский, стремился всячески наложить руку на владения монастыря, пожалованные согласно тестамента Анной Гойской в вечное владение. Не смотря на строгие санкции завещания, он отобрал земли вокруг монастыря, в частности те, на которых располагался монастырский колодец и пруд, обеспечивавший монастырь водой. Тогда преподобный Иов благословил выкопать колодец прямо на горе, что снижало вероятность обнаружения воды почти до минимума. Однако по молитвам святого вода показалась уже на глубине 46 метров. Этим колодцем монастырь пользуется и до сего дня. В конце концов, после многолетних тяжб монастырю все же удалось выиграть судебный процесс о монастырских угодьях и в 1647 г. Андрей Фирлей вынужден был признать безрезультатность своих посягательств и подписать мировую с Почаевскими иноками.
В этом также прослеживается некое сходство двух великих строителей — Феодосия Печерского и Иова Почаевского: оба они активно участвовали в общественной жизни своего времени, если этого требовал их пастырский долг и игуменское послушание. Причем преп. Иов самолично являлся на все судебные прения по вопросу земельных притязаний, не гнушаясь судебной волокиты, поскольку в этом заключалась защита юридических интересов монастыря, в котором подвизалось собранное им словесное стадо. Однако вне юридической сферы преподобный являл свою крайнюю снисходительность к человеческим немощам. К примеру, однажды, когда он застал в монастырской житнице человека, воровавшего зерно, то не только не воспрепятствовал ему в этом, но и сам помог взвалить на плечи мешок с краденым, лишь напомнив о страхе Божьем и конечном ответе за содеянное.
Благодаря подвигам и неустанным стараниям преподобного Иова в Почаеве были открыты школа и типография. Немало изданий особо важных в условиях католической экспансии в Западной Руси увидели свет в собственной типографии Почаевского монастыря, учреждённой попечением преп. Иова. Доныне на улицах Почаева шумят трехсотлетние липы, посаженные преп. Иовом, а зеркальная вода выкопанного им колодца, что на вершине горы, и пруда у её подножия и теперь свидетельствуют о великих трудах, положенных им на благо Почаевской обители.
Незадолго до смерти преподобный успел обнести монастырь оборонной стеной. Через четверть века во время Збаражской войны 1675 г., когда 50-тыс. отряд турок и татар осаждал монастырь, именно на этой стене явилось чудесное предстательство монастырю и всем в нём укрывавшимся от вражеского набега Царицы Небесной с распростертым омофором в руках, небесными ангелами и сопровождавшим Её преподобным Иовом, умолявшем Богородицу: «да не предаст в неволю монастыря сего».
Несомненно, судебные тяжбы и публичные попечения о вверенном ему монастыре были лишь эпизодом в жизни великого подвижника. Главное, чем и преп. Феодосий, и преп. Иов благоустраивали и созидали свои обители, была глубокая сердечная молитва, настолько глубокая, что творить её преподобные удалялись в глубокую пещеру, пребывая в ней многие дни и даже недели. При чём пещерка преп. Иова на горе Почаевской была настолько узкой и крохотной, что до сего дня пролезть в неё может лишь человек достаточно худого телосложения. Да и тому порой не хватает дерзновения пробраться в место, где преподобным было пролито столько сердечных слёз «о мире, во зле лежащем», как выразился преп. Досифей в житии.
Несмотря на свои молитвенные подвиги и строжайший пост, преп. Иов прожил долгую жизнь и почил 10 ноября 1651 г. в возрасте 100 лет. За два года до смерти преподобный назначил себе преемника, им стал будущий жизнеописатель преп. Иова — игумен Досифей. Даже в день своей кончины преподобный отслужил Божественную литургию и мирно, безо всякой болезни, отошел ко Господу.
Семь лет и 9 месяцев пролежало в земле его тело после погребения. Хотя в сущности погребено оно было ещё при жизни в той тесной Почаевской пещерке, словно во гробе, для страстей и суеты мира сего. 28 августа 1659 г. митр. Киевский Дионисий (Балобан) возглавил торжественное обретение нетленных мощей преподобного, на которых остались заметны даже язвы на ногах после отёков от длительного молитвенного стояния. Житие преп. Иова почти ничего не сообщает об этих язвах. Но весьма вероятно, что усвоение за преподобным имени Иова в честь прав. Иова Многострадального, которое он носил, будучи в малой схиме, непосредственно связано именно с величайшим терпением преподобного многих болезней при соблюдении им глубочайшего смирения и столпнического молитвенного стояния.
Тогда же мощи преп. Иова были перенесены на поклонение богомольцам в воздвигнутую незадолго перед тем Троицкую церковь (1641–47). Празднование памяти преп. Иова установлено: 19 мая (память прав. Иова Многострадального), 10 сентября (перенесения мощей), 10 ноября (преставление) (даты по нов. ст.).